MEBOER色譜柱柱效高、分(fēn)離能(néng)力強、保留機理(lǐ)清楚,是液相色譜分(fēn)離模式中(zhōng)使用(yòng)最為(wèi)廣泛的一種,對于生物(wù)大分(fēn)子、蛋白質(zhì)及酶的分(fēn)離分(fēn)析,反相液相色譜正受到熱烈歡迎。
色譜柱使用(yòng)一段時間後,常遇到柱子被污染,柱效會有(yǒu)一定程度的下降,采用(yòng)适當的方法對色譜柱進行保護,可(kě)以延長(cháng)色譜柱的使用(yòng)壽命。
樣品和流動相的處理(lǐ):溶解的樣品進樣前用(yòng)濾膜過濾,以除去不溶物(wù)。如果必要,需進行樣品的預處理(lǐ)。流動相中(zhōng)如有(yǒu)不純物(wù)質(zhì)将影響柱效,所以溶劑盡量使用(yòng)色譜的,少是分(fēn)析純,流動相使用(yòng)前用(yòng)微孔薄膜過濾。在流動相的輸液管前安(ān)裝(zhuāng)過濾器。過濾器定期用(yòng)甲醇超聲清洗,如果效果不好,可(kě)用(yòng)10%的稀硝酸浸泡清洗。對于堵塞嚴重的過濾器,可(kě)在火焰上灼燒後再清洗。
保護柱(預柱)的使用(yòng):對于較昂貴的色譜柱,可(kě)以在柱前加一保護柱,防止樣品中(zhōng)雜質(zhì)污染分(fēn)析柱,對于制備柱,因其進樣量大,使用(yòng)保護柱尤為(wèi)重要。
常規處理(lǐ):矽膠、氧化鋁、極性鍵合相色譜柱每一次用(yòng)完後用(yòng)低流速長(cháng)時間的二氯甲烷或正己烷等溶劑沖洗;鍵合相矽膠色譜柱、離子交換色譜柱和凝膠色譜柱先用(yòng)蒸餾水沖洗,再用(yòng)甲醇沖洗,然後用(yòng)甲醇與蒸餾水以一定比例混合的溶液沖洗後過夜。
MEBOER色譜柱對于已使用(yòng)一段時間後柱效下降的色譜柱可(kě)按以下方法進行再生。再生處理(lǐ)包括活化(右→左)和淨化(左→右)兩種。矽膠、氧化鋁、極性鍵合相色譜柱按下列順序沖洗:基戊烷或己烷←→三氯乙烷←→乙酸乙脂←→丙酮←→乙醇←→水。鍵合相矽膠柱:蒸餾水←→甲醇(沖洗過程中(zhōng)可(kě)加入少量二甲基甲酰胺)。離子交換樹脂柱:高濃度的NaCl溶液(1-2molL的NaCl溶液)可(kě)使大部分(fēn)樹脂再生,油脂等少數與樹脂緊密結合的物(wù)質(zhì)可(kě)用(yòng)低濃度堿溶液(如0.1molL的NaOH溶液)沖洗,酸性有(yǒu)機物(wù)吸附在固定相的用(yòng)低pH緩沖液沖洗,堿性有(yǒu)機物(wù)用(yòng)高pH緩沖液沖洗,然後再用(yòng)蒸餾水←→甲醇←→二氯甲烷←→甲醇←→蒸餾水沖洗。凝膠色譜柱:由于凝膠色譜柱是根據被分(fēn)離物(wù)質(zhì)的分(fēn)子量大小(xiǎo)而分(fēn)離物(wù)質(zhì),通常用(yòng)稀的氫氧化鈉或非離子型去垢劑(0.2%-1%NP-40或Lubrol)沖洗可(kě)除去大部分(fēn)的結合物(wù)質(zhì),如果一些污染物(wù)仍然不能(néng)清除時,用(yòng)24%或30%乙腈沖洗過夜可(kě)除去疏水蛋白,用(yòng)30%-50%乙酸可(kě)除去親水蛋白,用(yòng)蛋白水解酶處理(lǐ)可(kě)分(fēn)解凝膠中(zhōng)剩餘的痕量胃蛋白酶,然後再用(yòng)蒸餾水←→甲醇←→蒸餾水沖洗。
已污染的色譜柱的處理(lǐ):因保留強的物(wù)質(zhì)污染,流動相或樣品中(zhōng)不溶物(wù)沉積于柱頭,可(kě)用(yòng)下列方法洗滌:去除脂類可(kě)用(yòng)四氫呋喃、乙腈或甲醇洗滌;去除蛋白質(zhì)可(kě)用(yòng)乙腈、丙醇和1%CCl3COOH進行梯度洗脫;一些高疏水性化合物(wù)可(kě)用(yòng)乙腈或甲醇洗脫,同時反複注入100-200ml的四氫呋喃。
柱頭處理(lǐ):對于MEBOER色譜柱柱頭堵塞污染嚴重的情況而且用(yòng)溶劑沖洗無效的色譜柱,隻有(yǒu)打開柱子去除柱頂的填料重裝(zhuāng):先拆下不鏽鋼燒結過濾器,檢查柱床,常見凹陷或受污染的帶色填料,剔去不規則床層和帶色填料,使柱床顯白色并*水平,再用(yòng)甲醇作(zuò)糊狀填料勻漿液,将糊狀填料勻漿液滴在柱上靠重力從勻漿液中(zhōng)排出甲醇液,重複直到填料水平。